文献分享|7,8-DHF对骨重建的双重调节机制探寻
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----前言----
骨是一种动态的、不断更新的组织，在整个生命周期中经历了重大的改变。骨重塑整合了成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收，以及骨基质内的骨细胞和覆盖骨表面的成骨细胞衍生的衬里细胞。破坏骨吸收和骨形成之间的平衡会导致骨质疏松、多发性骨髓瘤和骨石化等骨疾病。
大量因素参与调节骨形成。已经证明，脑源性神经营养因子（BDNF）可以促进成骨细胞分化、迁移和骨折愈合。BDNF是神经营养因子家族的成员，主要通过与跨膜受体酪氨酸激酶B（TrkB）结合来调节多种生物过程。尽管如此，BDNF诱导的TrkB信号在10分钟时为瞬时信号，在60分钟时为峰值信号。但BDNF的半衰期很短，不容易穿过血脑屏障。使用重组BDNF的几项临床试验的结果也令人失望，可能是因为BDNF的体内半衰期短和传递不良。这些缺点给BDNF的临床应用带来了不可逾越的障碍。7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）是一种植物源性类黄酮，能够克服BDNF的上述限制，并被鉴定为功能性BDNF模拟物，现已在各种生化和细胞系统中验证其能够诱导TrkB二聚并激活其下游信号分子。
脑源性神经营养因子（BDNF）
7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）
然而，7,8-DHF是否可以作为骨重塑的调节因子并发挥抗骨质疏松的作用；TrkB是否介导7,8-DHF诱导的成骨细胞生成与Wnt/β-catenin信号之间的相互作用，其机制尚未明确。由此，浙江大学生物系统工程与食品科学学院张英实验室与美国埃默里大学医学院病理与检验医学系叶克强实验室合作研究后，在Elife(IF=8.14)上发表题为《7,8-Dihydroxyflavone modulates bone formation and resorption and ameliorates ovariectomy-induced osteoporosis》的研究论文，对BDNF和7,8-DHF对骨祖细胞MC3T3-E1成骨细胞生成和RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨细胞生成的影响，特别是阐明7,8-DHF功能的分子机制进行相关验证分析。
实验开始前，对10至11周龄的Sprague-Dawley雌性大鼠进行5天的驯化，所有大鼠均在特定的无病原体条件下保存。大鼠在全身麻醉下进行假手术（n=7）或双侧卵母细胞移植（n=21）。手术恢复一周后，将OVX大鼠随机分为三组：含载体的OVX组（OVX，n=7）、低剂量7,8-DHF组（OVX-L，n=7,5mg/kg/天）和高剂量7,8-DHF组（OVX-H，n=7,10mg/kg/天）。在组分配期间使用掩蔽。7,8-DHF溶于5%二甲基亚砜/95%甲基纤维素（0.5%，wt/vol）中。溶媒或7,8-DHF溶液均灌胃给药12周。在实验期间，允许所有大鼠自由饮用蒸馏水，并喂食标准大鼠饲料。
实验期间每周记录大鼠的体重。在处死大鼠前1天，从单独放置在代谢笼中24小时且不提供食物的大鼠中收集尿液样本。剖腹手术前，采集血样，然后通过离心收集血液制备血清。尿液和血清样本均储存在80˚C下进行生化测定。从每只大鼠身上取出子宫，并立即称重。解剖股骨并填充4%多聚甲醛，并将其储存在4˚C下，用于通过DXA测量骨密度，通过微型计算机断层扫描测量骨小梁微结构，以及骨组织形态计量分析。清洁右侧胫骨的附着组织，用生理盐水浸泡的纱布包裹，并将其储存在80˚C下，以测量压缩试验。
文章中用到的抗体：
| 产品名称 | 货号 |
| Anti-GSK3 beta antibody | ET1607-71 |
Anti-Phospho-GSK3 beta(Ser 9) antibody | ET1607-60 |
| Anti-Smad2 antibody | ET1604-22 |
| Anti-Phospho-Smad2 (S250) antibody | ET1612-32 |
| Anti-TAK1 antibody | ET1705-14 |
| Anti-ADAMTS5 antibody | ER1903-32 |
均来自华安生物，主要用于WB实验。
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The protein levels of p-GSK3β and GSK3β
The protein levels of matrix metalloprotein-9 (MMP-9) and Adamts5. GAPDH was used as an internal control.
研究发现，BDNF和7,8-DHF均促进MC3T3-E1细胞的增殖、成骨分化和矿化。这些效应可能归因于Wnt/β-catenin蛋白信号通路的激活，因为cyclin D1、p-GSK3β、β-catenin、Runx2、Osterix和OPG的表达均显著上调。β-catenin的敲除抑制了7,8-DHF刺激的Runx2和Osterix的上调。特别是通过其特异性抑制剂K252a阻断TrkB抑制7,8-DHF诱导的成骨细胞增殖、分化和成骨基因的表达。此外，BDNF和7,8-DHF抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化。转录因子c-fos和破骨细胞基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白-9（MMP-9）、Adamts5被7,8-DHF抑制。更重要的是，在卵巢切除（OVX）大鼠模型中，7,8-DHF可减轻骨丢失，改善骨小梁微结构、胫骨生物力学特性和骨生化指标。目前的研究强调了7,8-DHF对骨重建的双重调节作用。
论文链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8285109/
在这篇精彩的研究中，涉及到骨形成与骨质疏松的多个蛋白靶点，华安生物也有大量相关产品，欢迎大家前来咨询。
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迄今为止，公司已为各个领域完成 10000个定制科研抗体项目，为工业级客户开发IVD诊断用肿瘤标志物系列抗体原料和食品安全检测相关抗体百余种，为制药公司提供包括PD1和PD-L1热门靶点在内的早期抗体药物筛选十余种。
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